1.細(xì)胞接種

　　細(xì)胞數(shù)量：通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入約2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入5000～10000個細(xì)胞。具體數(shù)量需根據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞增殖速度等決定。

　　培養(yǎng)時間：一般建議貼壁生長24小時，讓細(xì)胞充分貼壁且生長狀態(tài)穩(wěn)定，便于后續(xù)實驗操作與結(jié)果分析。

　　接種混勻：接種時注意細(xì)胞懸液一定要混勻，避免細(xì)胞沉淀導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等。可以每接種數(shù)孔即混勻一下，確保細(xì)胞分布均勻。

　　2.藥物處理

　　設(shè)置對照：需設(shè)置空白組和對照組，空白組不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基，用于扣除本底OD值；對照組加入細(xì)胞和培養(yǎng)基但不添加藥物，用于對比藥物處理組的細(xì)胞存活情況。

　　藥物濃度與體積：根據(jù)實驗?zāi)康暮图?xì)胞特性，配制不同濃度的藥物溶液，并按一定體積加入到相應(yīng)的細(xì)胞孔中，如每孔加入10μL不同濃度的藥物刺激液。

　　3.孵育條件

　　溫度：一般哺乳動物細(xì)胞建議在37°C下進(jìn)行孵育，其他種屬的細(xì)胞可根據(jù)其特定的細(xì)胞培養(yǎng)條件選擇合適的溫度。

　　氣體環(huán)境：需在含5% CO?空氣及濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，以維持細(xì)胞的正常生長環(huán)境。

　　孵育時間：根據(jù)不同實驗細(xì)胞需求選擇適當(dāng)?shù)姆跤龡l件和時間。例如，加藥后的孵育時間可設(shè)置時間梯度，通過觀察數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（一般在1.0左右）等來選擇孵育時間。

　　4.CCK8試劑添加

　　添加時機(jī)：在藥物孵育結(jié)束后，向每孔中加入適量的CCK-8溶液，一般為10μL。注意不要在一開始就加入CCK-8，否則會影響藥物的作用效果和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　試劑用量：按照說明書的體系加入合適的CCK-8含量。如果細(xì)胞體系較大，可適當(dāng)增加CCK-8的量，但要注意避免試劑過量或不足影響檢測結(jié)果。

　　5.CCK8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒吸光度測定

　　測定波長：使用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度，此波長是CCK-8試劑檢測的適宜波長。

　　測定時間：在加入CCK-8試劑后，需再次孵育一段時間再進(jìn)行吸光度測定。對于不同的細(xì)胞類型，孵育時間有所不同，如白細(xì)胞較難顯色，可能需要較長的CCK-8反應(yīng)時間或增加細(xì)胞數(shù)量；懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比也較難顯色，孵育時間一般為1-4小時，多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)30分鐘左右即可肉眼觀察到明顯的顯色反應(yīng)，培養(yǎng)3.5-4小時左右檢測效果佳。

　　6.結(jié)果計算與分析

　　細(xì)胞存活率計算：細(xì)胞存活率=（實驗孔OD值-空白孔OD值）/（對照孔OD值-空白孔OD值）×100%，通過該公式計算出各組細(xì)胞的存活率，從而評估藥物對細(xì)胞的增殖或毒性影響。

　　數(shù)據(jù)分析：盡量多設(shè)置復(fù)孔，取平均值以減少誤差。同時，可通過繪制細(xì)胞存活率曲線等方式直觀地展示藥物濃度與細(xì)胞存活率之間的關(guān)系。